原核生物 (Prokaryotes)

原核生物 (Prokaryotes)
├─ 細菌 (Bacteria)
│  ├─ 無細胞壁（極少）
│  └─ 有細胞壁（多為 peptidoglycan）
│     ├─ Gram(+)結晶紫/藍色: 厚peptidoglycan、無外膜
│     └─ Gram(-)番紅/粉色: 薄peptidoglycan、有外膜 + LPS脂多糖
└─ 古菌 (Archaea)
   └─ 細胞壁非典型（無法用Gram染色區分）

細菌分三類：無細胞壁（極少）、有細胞壁（很薄）、有細胞壁（很厚）

革蘭氏染色 主要用在「有細胞壁的細菌」上
可鑑別細菌的細胞壁厚度、結構差異

染色步驟：
１　結晶紫 Crystal violet（紫色染料）→ 所有細菌一開始都變紫色
２　碘液 Iodine（固著）→ 碘液和結晶紫結合，形成 CV-I（結晶紫-碘）複合物
此時分子更大、使顏色更容易卡在肽聚糖結構，更不容易被洗掉
３　脫色 Decolorizer（酒精/丙酮）→ 肽聚糖「薄」的細菌的染劑顏色被洗掉了，「厚」的細菌則比較難洗（然而只要泡太久也會被洗淡）
４　復染 Counterstain（番紅染料）→ 被脫色的細菌復染變粉紅；留紫的仍是紫色

把細菌染色完之後，一翻兩瞪眼
呈現紫色稱為 革蘭氏陽性菌：G(+)
呈現粉色稱為 革蘭氏陰性菌：G(-)

革蘭氏染色的陽性/陰性是「顯色反應」，不是「有無細菌」，無菌應呈現透明無色
（跟感冒確診、有反應的陽性/陰性 無關）

肽聚糖 peptidoglycan

肽聚糖結構：
1. 一個糖鏈像一根竹筷子，竹筷子是由竹節（-NAG-NAM-, 兩個糖反覆交替）組成
2. 竹筷子與竹筷子之間，用 crosslink 一根綁一根，做成一艘竹筏，就是一層肽聚糖
3. 在多層竹筏時，竹筏與竹筏層層之間，靠著磷壁酸（Teichoic acid 台口酸）打樁固定、垂直加固

[-⬡⬢-]n <- 糖類
    | 
    o <- peptide胜肽
    o
    o
    o


備註：
⬡=NAG(β-GlcNAc)
⬣=NAM(β-MurNAc)
[-⬡⬢-]n = ...-⬡-⬢-⬡-⬢-⬡-⬢-⬡-⬢-⬡-⬢... = 一根竹筷子
o=胺基酸殘基(接在⬢上)

G(-) 單層的肽聚糖：3 -> 4 crosslink。只有薄薄的1-2層樓平房
G(+) 多層的肽聚糖：3 -> 4 crosslink，中間有 (glycine)₅ 長橋來連接

施工前：L-Ala – D-Glu – L-Lys – D-Ala – D-Ala（五個胺基酸）
施工後：L-Ala – D-Glu – L-Lys – D-Ala （crosslink完畢；留下四個胺基酸）

注意：此處 L-Ala – D-Glu – L-Lys – D-Ala – D-Ala 混雜了L-from / D-form的氨基酸
（生物界幾乎都是使用 L-form胺基酸，所以此處 D-form胺基酸 可能會考）

G(+) 因為有20-40層樓高的大廈，層層之間 以高強度鋼筋 磷壁酸連接

磷壁酸（Teichoic acid 台口酸）：貫穿竹筏的樁
胞壁酸 (Muramic acid / N-acetylmuramic acid, NAM)：竹節上的插座

脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)

僅 G(-) 細菌具有
由 O-抗原、核心多糖、脂質A、組成

脂質A(Lipid-A) 是內毒素來源，是在外膜上
是「內毒素」但是在「外膜上」，這到底在講什麼？

• 外毒素(Endotoxin)：
  細菌分泌到外部，丟到環境中干擾或殺死其他菌。
  屬於「主動出擊」
  
• 內毒素(Endotoxin)：
  當細菌被吃掉了，會讓吞噬者中毒，自爆炸彈，讓你不敢吃我。
  屬於「被動防禦」

有點像 生日蛋糕的奶油
奶油是放在「盒子內部」但是是在「蛋糕的最外層」

如果比喻 奶油=毒素來源
可以說「盒子內」的東西有毒，也可以說蛋糕的「最外層」奶油有毒

G+/G- 二分法的例外

當然，不是只有 G+/G- 二分法，生物總有例外

ex:
藍綠菌 (cyanobacteria) 有外膜，雖被歸類在G-，但肽聚糖層比一般G-厚很多，介於G+與G-之間
分枝桿菌 (mycobacteria) 演化上接近 G+ 但是細胞壁外有一層黴菌酸 (mycolic acid)，因為防潑水，正常革蘭氏染色染不上去
黴漿菌 (mycoplasma) 是裸奔的細菌，沒有肽聚糖、沒有外膜，只有強化過的細胞膜
內孢子 (endospore) 可視作細菌的「種子」，處於休眠狀態。擁有硬殼，角蛋白外殼

古菌 (archaea) 則難以分類。多數是 S-Layer（醣蛋白/蛋白質，而非多醣類），有些看著像肽聚糖，實則是偽肽聚糖 (pseudopeptidoglycan)，糖骨架不同、且crosslink全都是 L-型胺基酸（與一般細菌不同）

細菌很怕的東西

G(-) 細菌有LPS保護，這招不一定管用（但生物體和科技有發展出不同攻擊段）
G(+) 細菌只有肽聚糖，所以很怕這招：

針對肽聚糖的攻擊手段

1. 溶菌酶（lysozyme）
溶菌酶會將 細菌細胞壁的肽聚糖鍵結(β1->4)打斷，破壞細菌細胞壁

「細菌沒細胞壁」很嚴重！
因為無法透過細胞壁來維持形狀，內外滲透壓差
導致大量水分子湧入細胞膜內，細菌大量吸水、像氣球一樣膨脹爆掉

溶菌酶廣泛存在於：

• 眼睛淚液：眼球沒皮膚罩住，卻沒有細菌入侵
• 雞蛋蛋白：即便有點微小裂縫，營養的雞蛋可在常溫久放
• 噬菌體：需要孔洞將DNA注射進入細菌

2. 萬古霉素 (Vancomycin)

crosslink的 受質（繩子末端）是 D-Ala-D-Ala
萬古霉素是巨大的夾子、手套，可以套住每一根繩子末端的 D-Ala-D-Ala
等同「沒收了繩子的功能」
繩子在被捆綁、形成竹筏之前，就被罩住

屬於糖肽類 (glycopeptide) 抗生素

3. 盤尼西林 (Penicillin 青黴素)

糖鏈之間的 crosslink 是透過 transpeptidase (轉胜肽酶) 完成，會將鏈與鏈之間的繩頭綁一起、打結
（糖鏈=竹筷子；胜肽鏈=細繩子）
然而，盤尼西林的 Lactam Ring 四角環，長得像繩頭（肽鏈末端）

為了打結，酵素會去找繩頭，卻誤把它當成受質結合，結果形成共價鍵
（拔不掉、黏上強力膠的概念），然後酵素就報銷了
最終讓鏈與鏈之間無法crosslink，抑制肽聚糖的形成

β-lactam（內醯胺類，四元環結構）的抗生素都有此功能
作為冒牌貨與酵素結合、使得酵素「報銷」了
所以能夠殺死細菌，因為細菌沒有細胞壁了，很嚴重滴

補充：其實不是β-lactam長得像繩頭形狀，而是反應過程的某瞬間特徵很像

溶菌酶：直接拆牆。拿著超大型的剪刀剪牆的「磚塊鏈」
萬古霉素：沒收繩子的功能。體型中等，像夾子擋住、把繩頭藏起來
盤尼西林：暗殺掉酵素。體型最小，像一個子彈卡死在酵素活性位
（體型大小比約 40 : 4 : 1）

75% 酒精殺菌原理？

（此處是殺細菌，不是病毒）
酒精行經路徑：
外膜（G+無／G-才有） -> 肽聚糖（竹筏層） -> 細胞膜 -> 細胞質（細胞膜內）
最終使蛋白質變性

對G(+)細菌而言，死因是蛋白質變性
對G(-)細菌而言，死因是外膜被溶解（細菌此時就差不多掛了）加上讓蛋白質變性

濃度太高的酒精(95%)會讓殺菌效果變差？
酒精會讓肽聚糖層（竹筏層）脫水、產生收縮，加上讓表層蛋白快速凝固，使得整體的蛋白質變性效果變差

75% 酒精竹筏層收縮得慢，酒精仍可通暢進入到細胞膜內，達到殺菌效果
95% 酒精竹筏層收縮得快、加上蛋白質凝固太快，反而在外形成一個類似屏障結構保護內部，讓酒精更難以進入深處，不容易完成「全面性的破壞」

所以 95% 酒精對G(+)效果較差，對G(-)殺菌效果會下降但仍存在
G(-)失去外膜後，細菌多半就嗝了，因為滲透壓差大，薄薄的肽聚糖會支撐不住而爆掉、瓦解
G(+)雖然沒有外膜，不過有厚厚牆壁層 和 磷壁酸來維持穩定性

酒精也能殺「具有外套膜的病毒」

為何噴酒精，嬌貴的人類卻沒事？
酒精對人體而言，皮膚最外層是一層厚重的角質層（由一大堆 堆滿「角蛋白」的死掉的細胞組成，或稱堆屍體）
所以可以殺死表面的細菌，
卻很難穿透這堆屍體牆、傷害不到深處還活著的基底細胞

但是直接喝75%酒精進人體，就是另一回事了
消化道黏膜完全沒有這層屏障，細胞會灼傷、大量死亡而且死得很慘
譬如高濃度酒精
沒有稀釋直接喝是高強度的刺激，容易造成黏膜損傷、灼傷
ex: 波蘭Polmos伏特加 96%生命之水